Extraccion de ADN

EXTRACCIÓN DE ADN DE TOMATE (Solanum lycopersicum)

APONTES JAIR

MARTINEZ ARGEMIRO

MERLANO YILINA

PEREZ JAVIER

ASPECTOS TEORICOS

El tomate o jitomate (Solanum lycopersicum) es el fruto de la tomatera, una planta de la familia de las solanáceas. Planta bienal, crecida como una planta anual, hasta 1 a 3 m, con un débil tallo que se intercala con otras plantas. Las hojas tienen 10 a 25 cm de largo, pinadas, con 5 a 9 folíolos, donde cada foliolo tiene 8 cm de largo, con márgenes serrados; tanto tallo como hojas están muy vascularizados. Las flores tienen 1 a 2 cm, amarillas, con cinco lóbulos en la corola; crecen en racimos de 3 a 12 flores juntas. La fruta es una baya muy coloreada clásicamente rojo, por el pigmento licopeno, de 1 a 2 cm de diámetro en plantas silvestres, y mucho más grandes en las variedades cultivadas.

La agarosa es un polisacárido formado por alfa y beta galactosas que se extrae de las algas de los géneros Gellidium y Gracillaria. La agarosa es soluble en agua a temperaturas superiores a los 65ºC, dependiendo del grado de sustituciones hidroxietílicas de sus cadenas laterales. Sustituciones las cuales, se pueden modificar para provocar que la temperatura de gelificación varíe entre los 17 y los 40ºC. La agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte y no tóxica que supone una herramienta indispensable en gran cantidad de técnicas de Biología Molecular, Bioquímica y Biología Celular. Su uso más extendido es para construir geles que permitan separar moléculas de ADN mediante electroforesis, además de ser utilizada para fijar moléculas a su estructura como anticuerpos o antígenos. Igualmente se utiliza para el cultivo celular y microbiología. Otros usos menos extendidos son la utilización de estos geles como matrices en la reparación de tejidos dañados.

MATERIAL Y REACTIVOS

• Tomate de diferentes clases

• Agua destilada

• NaCl

• NaHCO₃

• Detergente líquido o champú

• Alcohol isoamílico a 0ºC

• Agarosa

• Tampón TAE

• Micropipetas

• Batidora

• Nevera

• Centrífuga

• Vaso

• Tubo de ensayo

• Varilla fina

FUNDAMENTO

La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por romper las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas más pequeñas y separadas de él por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamílico.

PROCEDIMIENTO

1.1 Para la extracción de ADN

1. Preparar el tampón con los siguientes ingredientes y mantener en la nevera o en un baño de hielo triturado:

• 120 ml de agua destilada.
• 1,5 g de NaCl.
• 5 g de bicarbonato sódico (NaHCO₃)
• 5 ml de detergente líquido o champú.

2. Tomar las diferentes clases de tomate y cortarlas en cuadraditos.

3. Triturar cada muestra por separado con un poco de agua en la batidora accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos. Así se romperán muchas células y otras quedarán expuestas a la acción del detergente.

4. Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampón frío y agitar vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar después los restos vegetales más grandes. Lo ideal es centrifugar a baja velocidad 5 minutos y después pipetear el sobrenadante.

5. Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y añadir con pipeta 10 ml de alcohol isoamílico enfriado a 0ºC. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo éste inclinado. El alcohol quedará flotando sobre el tampón.

6. Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separación entre el alcohol y el tampón. Remover la varilla hacia delante y hacia atrás y poco a poco se irán enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedará adherido a su extremo con el aspecto de un copo de algodón mojado.

1.2 Preparación del gel de agarosa de bajo punto de fusión

1. En un matraz de 250 ml de capacidad añadir:

• 30 ml de tampón TAE (0.04 M Tris-acetato; 0.001 M EDTA)
• 0.9 gramos de agarosa de bajo punto de fusión

2. Calentar hasta que se funda la agarosa

3. Dejar enfriar hasta aproximadamente 50ºC y añadir 3 µl de solución de bromuro de etidio (10 mg/ml)

4. Mientras se enfría la agarosa, sellar con cinta adhesiva el molde en el que se preparará el gel. Colocar el molde en una superficie horizontal y situar el peine que labrará los pocillos a unos centímetros del borde.

5. Una vez se ha enfriado la agarosa hasta 50ºC, añadir esta solución al molde con cuidado de retirar las burbujas que se formen. Dejar gelificar la agarosa hasta que adquiera una apariencia translúcida.

6. Retirar el peine y la cinta adhesiva. Colocar el gel en la cubeta de electroforesis y cubrirlo con tampón de recorrido (TAE).

2.2. Electroforesis

1. Con cuidado de no romper los pocillos, cargar en el gel las diferentes muestras de ADN digerido. Para ello, añadir 4 µl de tampón de carga a los tubos en los que se desarrolló la digestión y, una vez mezclado ADN y tampón de carga, ayudados de una micropipeta, cargar dicha mezcla en un pocillo del gel.

2. Conectar la fuente de alimentación al gel y correrlo durante 2 horas a 50 volts/cm.

3. Analizar los resultados mediante observación del gel en un transiluminador, tratando de identificar sobre los rastros de ADN genómico los monómeros del ADN satélite.

DISCUSIÓN

La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por romper las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se fraccionan en cadenas más pequeñas y separadas de él por acción del detergente. El alcohol se utiliza para precipitar el ADN que es soluble en agua pero, cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. La electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que es empleada para desplazar las moléculas a través del gel. Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las moléculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el cátodo si están cargadas positivamente y hacia el ánodo si están cargadas negativamente (en electroforesis, los electrodos se comportan igual que en una cubeta electrolítica. En los ácidos nucleicos la dirección de migración es del electrodo negativo al positivo, y esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azúcar-fosfato. En los fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hélice) la velocidad de migración es proporcional a su tamaño. En fragmentos simples de ADN (una sola cadena) y ARN, dichas moléculas tienden a plegarse de forma compleja y a migrar de forma complicada, según la estructura terciaria formada tras el plegamiento. En la anterior práctica, los datos arrojados muestran que en las pulpas fue el lugar donde se encontró mayor cantidad de ADN siendo la del tomate transgenico la de mayor visualización, explicándose por el echo en que en la pulpa es la zona en donde se encuentra la mayor concentración de células, además esta parte del tomate presenta una mayor accesibilidad a los procesos de extracción como lo son la maceración y filtración.

Por lo tanto podemos concluir que la extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas. En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por último hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol y que los resultados obtenidos son de forma cuantitativa mas no cualitativamente.

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